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烧伤瘢痕脂肪移植通过对瘢痕和脊髓的抗炎作用减轻神经病理性疼痛 3 身材总监烫伤压力衣定制
来源: | 作者:身材总监 | 发布时间: 2021-03-14 | 217 次浏览 | 分享到:

烧伤瘢痕脂肪移植通过对瘢痕和脊髓的抗炎作用减轻神经病理性疼痛 3 身材总监烫伤压力衣定制


脊髓背角IL-1β和TNF-α的测定

解剖腰段脊髓。脊髓背角组织在溶解缓冲液中均质化。双肌酸蛋白质分析(Pierce)用于检查蛋白质浓度。与之前的研究一样进行ELISA。标准曲线包括在每个实验中。采用酶联免疫吸附测定试剂盒(eBioscience,USA)定量检测IL-1β和TNF-α水平。酶联免疫吸附测定试剂盒的参考范围为0至1400(IL-1β)和0至750(TNF-α)pg/mL。所有测量值记录一式三份。

免疫荧光法检测p-IκB和p-NFκB

脂肪移植或载体治疗4周后取腰段脊髓。新鲜冰冻切片的方法与前面提到的免疫组织化学方法相同。对于双重免疫荧光染色,将脊髓背角与多克隆p-IκB(1:100稀释,细胞信号)和单克隆NeuN(神经元细胞标记,1:1000,密立浦,Temecula,CA);多克隆p-NFκB(1:100稀释,细胞信号,波士顿,MA);单克隆GFAP(星形胶质细胞标记,1:1000稀释,BD Biosciences San Diego,CA)和p-JNK(1:100稀释,Cell Signaling,Boston,MA)在4℃过夜。添加与山羊抗兔Cy3(red,Millipore,Temecula,CA)和山羊抗鼠Alexa面粉488(green,Invitrogen,Carlsbad,CA)结合的适当二级抗体。图像采集使用荧光显微镜(徕卡DMI6000)。

脊髓细胞凋亡的测定

取出L3至L5节段,并将其嵌入最佳切割温度化合物中,以制备切割成16 mm厚切片的冰冻切片。上一次报告[26]提到了这些程序。简而言之,在4°C下与NeuN一级抗体(1:1000,Merck Millipore,Bedford,MA)孵育后,根据制造商的建议(Millipore,ApopTag荧光素原位凋亡检测试剂盒S7110)使用TUNEL分析检测凋亡细胞死亡。然后将切片与Cy3结合抗鼠IgG孵育二级抗体(Merck Millipore,Bedford,MA)在室温下再持续1小时,用PBS冲洗3次,每次5分钟,并用含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的安装介质进行安装。

统计分析

统计分析采用SPSS软件(14.0版,伊利诺伊州芝加哥)。每个样品测量三次,数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)(大鼠,每组n=6)。组织细胞因子和westernblot检测采用单因素方差分析和Tukey配对比较,P<0.05,具有统计学意义。

结果

脂肪移植改善烧伤引起的神经病理性疼痛

烧伤后足皮肤炎症引起机械性痛觉超敏,PWT(g)显著降低。烧伤引起机械性痛觉超敏。假手术组或假烧伤加脂肪移植治疗组的PWL(s)和PWT(g)观察值无明显变化(图1B和1C)。烧伤后1周,PWT明显下降。大鼠后足皮肤脂肪移植后,5、6、7、8周时PWT(g)较烧伤盐水注射组明显升高。也就是说,与C组相比,脂肪移植物在烧伤后5~8周的抗伤害作用有显著差异;结果表明,脂肪移植物能改善烧伤引起的机械性痛觉超敏等疼痛。

脂肪移植物减少COX-2、iNOS和nNOS在免疫组织化学定位中的表达,并减弱后足皮肤中的蛋白表达

IHC染色图像(图2A)和蛋白表达(图2B)进一步证实,COX-2、iNOS和nNOS激活参与了烧伤后的后足皮肤。我们发现,烧伤后8周,后爪皮肤COX-2、iNOS和nNOS蛋白水平升高。治疗4周后,脂肪移植显著降低烧伤诱导的COX-2、iNOS和nNOS蛋白水平。

图2。IHC染色图像和COX-2、iNOS和nNOS在后足皮肤中的蛋白表达。

(A) 脂肪移植对三度烧伤后足皮肤炎症蛋白、COX-2、iNOS和nNOS表达的影响。(B) 烧伤后第8周后肢皮肤COX-2、iNOS和nNOS的westernblot分析。(上图)Western-blot图像显示,β-actin作为内对照。(底部)进行了定量结果分析,每个试验的样本量为n>3。脂肪移植组(D组)COX-2、iNOS、nNOS的表达明显低于盐水注射组(C组)。*P<0.05。

脂肪移植后脊髓背角的炎性COX-2、iNOS和nNOS蛋白及促炎细胞因子明显减弱

烧伤诱导脊髓背角多种炎性蛋白表达。与A组、B组和D组相比,烧伤后8周显示COX-2、iNOS和nNOS。与A组相比,B组的脂肪移植对这些蛋白质无显著影响。与D组相比,脂肪移植显著减弱脊髓背角的炎性蛋白质(图3A)。为了探讨脂肪移植对烧伤引起的神经病理性疼痛作用的可能机制,我们量化了脊髓背角中IL-1β和TNF-α的水平(图3B)。我们发现烧伤后足爪回缩潜伏期和脊髓炎性蛋白有明显的神经病理性疼痛。因此,评估促炎细胞因子;与C组相比,D组IL-1β和TNF-α水平显著降低。脂肪移植减轻了烧伤引起的神经病理性疼痛的神经炎症。

本信息并非旨在或暗示作为专业医疗建议的替代;不应在任何医疗紧急情况下使用,也不应用于任何医疗状况的诊断或治疗。所有医疗紧急情况请拨打120。

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