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皮肤瘢痕的再着色取决于伤口的原始类型 2
来源: | 作者:身材总监 | 发布时间: 2021-06-08 | 103 次浏览 | 分享到:

材料和方法
动物工作

所有程序都是根据内政部的条例和批准进行的。动物在进入研究之前至少被驯化2周,在受伤之前和之后分别被单独饲养1周。动物每天两次以标准的无抗生素饮食喂养(英国康尔顿,奥克斯),并可获得水。

所有程序均采用无菌技术。动物在全麻前一夜禁食。用2-4%吸入异氟醚、氧化亚氮和面罩补充氧气对4头杜洛克母猪进行麻醉。预期的伤处被剃去,用倍他定和氯己定水清洗皮肤。根据设定的模板,使用永久性标记在该动物上标记意图的地点。2厘米切口(IC)伤口用11刀制作,直到皮下脂肪,但不包括在内。2.5cm厚切口2用数字11刀制作,切取皮肤的全部厚度。部分厚度(PTE)伤口是在0.4毫米(努瓦格)的情况下,用一个25毫米刀片的手持式机动皮肤病造成的。伤口是在每只动物的两侧一排地造成的,以提供动物内的复制。无菌纱布轻按压止血。术后肌注丁丙诺啡0.3mg。皮肤伤口用释放型™(强生公司)非贴壁吸收敷料包扎,并用生物融合型™(Johnson&Johnson)粘合敷料和Surgifix™长袜固定。)。敷料每隔一段时间更换一次,直到所有伤口重新上皮化为止。伤口愈合的次要意图,没有任何干预(除了换药),没有伤口被感染。

刀疤收获

伤后第35、56、70、90天取瘢痕。在指定的时间点,动物被吸入异氟醚麻醉,用手术刀至筋膜切除疤痕,周围有5毫米的未受伤皮肤边缘。所有样品均被快速冷冻,埋入最佳切削温度化合物(OCT)中,保存在−80°C处,直至进一步使用。取同一动物的全厚度正常皮肤标本,在每个时间点进行比较。在第0天取出皮肤造成伤口也同样保存和保存分析。

冷冻

冷冻标本在厚度为5μm(Cryocut 1800,Leica)的条件下分步切片.切片切入(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APES)涂布的滑片上,丙酮固定10 min,空气干燥,存放在−20°C的密封塑料盒中,直至使用。DOPA氧化酶反应切片未固定,立即使用。

用单克隆抗体HMB 45对不同瘢痕内黑素细胞的时空分布进行了研究。HMB 45是一种检测早期黑素细胞和再激活的成年黑素细胞(如手术瘢痕内或邻近)的单克隆抗体(b 787,abcamm)(Smoller等)。利用酪氨酸酶相关蛋白1(TRP 1)的免疫检测技术(TA 99,ABCAM)和DOPA氧化酶染色法,检测酪氨酸酶产生黑色素细胞氧化成不溶性棕黑色素,研究黑素细胞的黑素生成和活性。用改良硝酸银染色Warkel-露娜Helwig染色检测黑色素.

多巴氧化酶染色

未固定的冰冻切片在4°C的4%甲醛固定剂中孵育1h前可达到室温。m酸钠缓冲液pH7.4在0.2%DOPA溶液中孵育或加热0.2之前m卡那酸钠缓冲液37°C作用4h(对照组)。培养后,用去离子水两次冲洗5 min,用核快速红染色,去离子水快速冲洗,分级醇脱水,再用二甲苯2次。幻灯片安装了Pertex和眼镜片。

沃克尔-露娜黑色素染色

冷冻切片在去离子水中冲洗30 min,在43℃下孵育30 min,用显影液(2%硝酸银、1%明胶和0.15%对苯二酚)浸泡,室温下在潮湿的染色槽中孵育8 min。开发人员在去离子水第二次冲洗之前,先用热水冲洗干净。切片用核快速红染色,在自来水中冲洗,通过分级醇脱水和二甲苯两种变化,然后安装Pertex和卷边。

免疫组织化学(TRP 1和HMB 45)

切片达到室温,用磷酸盐缓冲液(PBS)再水化15 min,加入0.3%过氧化氢和甲醇30 min,阻断内源性过氧化物酶。在含0.1%牛血清白蛋白的PBS中用1.5%驴血清封闭30 min前,用PBS-TritonX 100(各15 min)对切片进行两次冲洗。取血清,应用TRP 1 1/2 5 0,HMB 4 5 1/2 0稀释液。对照组接受进一步阻断血清,而不是一次抗体。用PBS-TritonX 100冲洗两次(每次15 min),应用生物素化驴抗小鼠1/200稀释液(Jackson实验室)在室温下孵育30 min。切片在PBS-TritonX 100和普通PBS中冲洗15分钟,然后在Vecathain ABC试剂中孵育30分钟(按制造商的指示制作)。在VecttanNovaRed应用前,在PBS和Tris-缓冲盐水(TBS)中再进行两次冲洗(各15 min)。反应通过在去离子水中浸泡而停止。切片经Harris苏木精染色,自来水冲洗5 min,经分级醇和二甲苯两种变化脱水后,用Pertex固定。

图像采集与分析

用Leica对染色片进行定量分析。克温软件。对每一次分析的每一次伤口进行了6次台阶切片的分析。每一节影象在650个-μm字段中,并在每个字段内,收集了染色阳性细胞的数量或黑色素沉积区域的数据(支持信息)。DOPA氧化酶和免疫组织化学检测细胞计数。在色素评价方面,测量了表皮的黑色面积(即WLH染色)和整个表皮面积。色素沉着面积表示为整个表皮面积的百分比。数据被输出并进行统计分析。

疤痕宏观再着色

使用视觉模拟疤痕(VAS)评分系统(Duncan等人),从标准化的数字摄影图像中对疤痕的再着色进行宏观评估。疤痕分为三个区域(图中)。图1)以便于评估每个疤痕的中心和周围。每个区域通过沿20厘米的记分栏画一条垂直线获得分数,其中−10表示完全的色素沉着,0表示“正常”,+10表示色素沉着。然后测量这个点,给出VAS评分。这些数据被整理成excel存档并进行统计分析。随着全层瘢痕的成熟,他们经历了一些挛缩,但仍在三个区域得分。进行评分器内验证,并在一致性确认后,对图像进行编码和盲目评分。

统计分析

用SPSS统计软件对数据进行非参数Kruskal-Wallis检验,比较时间点(无关数据)和Wilcoxon检验在同一动物体内的比较(相关数据)。一个P<0.05值被认为具有统计学意义。

结果
为总结该方法,对4头杜洛克母猪的两侧分别进行了切口、部分厚度切除和全厚度切除各2处(每只动物共12处)。在受伤后不同的时间点采集疤痕之前,用VAS评分法对伤疤进行拍照和宏观评估。用HMB 45抗体免疫组化法检测黑素细胞,DOPA氧化酶反应法和TRP 1免疫组化法检测活性黑素细胞。用WLH染色检测黑色素。从第0天开始的正常皮肤样本(例如,切除皮肤以造成伤口)和收获时的皮肤样本也同样被收集和处理。在650~μm的范围内,对处理后的瘢痕和正常皮肤的阶梯冰冻切片进行了分析,以便于在瘢痕边缘和疤痕中心收集和比较数据。

本信息并非旨在或暗示作为专业医疗建议的替代;不应在任何医疗紧急情况下使用,也不应用于任何医疗状况的诊断或治疗。所有医疗紧急情况请拨打120。

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